Pewarnaan Mikroorganisme

I  PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo, 2008).

Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).

Mengingat pentingnya hal tersebut, maka dibutuhan suatu keterampilan dalam mewarnai bakteri yang akan kita  amati. Oleh karena itu  maka perlu diadakan praktek mikrobilogi laut untuk pengecatan mikroorganisme sehingga dapat dibedakan dengan mudah struktur dan jenis bakteri dan jamur.

B.  Tujuan dan Kegunaan

Tujuandaripraktikummikrobiologiiniadalahuntuk mempelajari cara pewarnaan mikroorganisme dan mengetahui perbedaan antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif.

Sedangkankegunaandaripraktikummikrobiologidaripraktikuminiadalahsebagaibahanpembanding antara teori dan prakteksesuai yang didapatdalamreferensisertabahankuliahdengankenyataan yang ditemukan pada hasilpraktek. Serta dapat melakukan prosedur pewarnaan mikroorganisme dengan baik.

II  TINJAUAN PUSTAKA

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Rizki, 2008).

Menurut Yulneriwanti (2008), macam-macam pewarnaan terdiri dari:

1.    Pewarnaan negatif

Merupakan Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang dan ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti Spirochaeta.

2.    Pewarnaan sedehana

Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) dan bertujuan hanya untuk melihat bentuk sel.

3.    Pewarnaan diferensial

Merupakan pewarnaan yang menggunakan lebih dari satu macam zat warna dan bertujuan untuk membedakan antar bakteri. Misalnya pada bakteri tahan asam.

4.    Pewarnaan khusus

Merupakan pewarnaan yang hanya untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri. Misalanya  kapsul, spora, flagel dan lain-lain.

Untuk mempelajari morfologi, struktur, sifat-sifat bakteri dalam membantu mengidentifikasinya  kuman perlu diwarnai. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae (filzahazny, 2008).

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (filzahazny, 2008).

Teknik pewarnaan

Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio, basillus, dsb) dari bahan-bahan lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai (Hadiotomo, 1990).

Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Hadiotomo, 1990).

Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang khas dibentuk oleh spesies ini disebut endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia. Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras. Sifat-sifat ini menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya bila diperlukan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali pewarna memasuki endospora, sukar untuk dihilangkan. Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan untuk membedakan spesies-spesies bakteri yang membentuknya (Dwidjoseputro, 1989).

Menurut Hadiotomo (1990), ciri-ciri bakteri gram negatif dan bakteri gram positif yaitu:

1.    Bakteri Gram Negatif

a)     Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

b)     Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan ±terdapat didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit  10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.

c)     Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

d)     Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

e)     Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

f)      Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

2.    Bakteri Gram Positif

a)     Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.

b)     Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

c)     Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

d)     Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

e)     Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Sedangkan menurut Volk & Wesley (1998), pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu:

1.    Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

2.    Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

3.    Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

4.    Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

III.  METODE PRAKTEK

A.  Waktu dan Tempat

Praktek Mikrobiologi laut dilaksanakan pada hari Selasa12April 2011pukul 09.20 – 12.00 WITA dan bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Laut, Jurusan Ilmu Kelautan, Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan, Universitas Hasanuddin, Makassar.

B.  Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah objek gelas berfungsi untuk menaruh sampel, gegep berfungsi untuk menjepit objek glass, pipet tetes berfungsi untuk mencampur laurutan pada sampel, ose bulatberfungsi untuk memindahkan bakteri pada preparat, lampu bunsen berfungsi untuk mensterilkan alat dan mikroskop berfungsi untuk mengamati bakteri dan jamur.

Sedangkan bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah kapas, tissue rolll, larutan alkohol 70 % dan 96 % (Gram C), kristal violet (Gram A),mordant lugols lodine (Gram B), safranin (Gram D), immerson oil dan kertas serap.

C. Prosedur Kerja

Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Kemudian mensterilkan gelas objek, kover glass dengan menggunakan larutan alkohol 70% kemudian dikeringkan dengan tissue.Setelah itu meneteskan 1 tetes aqudes diatas objek glass kemudian mengambil sampel bakteriBacillus subtilisdengan menggunakan ose, kemudian di letakkan diatas objek glass yang berisi aquades tersebut. Setelah itu, kemudian memanaskan objek glass tersebut di atas lampu bunsen sampai kering dengan menggunakan gegep kayu.

Setelah kering dan dingin kemudian diteteskan Gram A (Larutan Kristal Violet) sebanyak 2-3  tetes dan dibiarkan selama 1 menit. Setelah sudah 1 menit kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Kemudian diteteskan lagi larutan Gram B (Larutan Mordant Lugol’s Iodine) dan dibiarkan selama 2 menit. Setelah sudah 2 menit kemudian dicuci lagi dengan air mengalir dan dikeringkan. Setelah itu diteteskan lagi larutan Gram C (Larutan Alkohol 96%) dan dibiarkan selama 15 detik. Setelah sudah 15 detik, kemudian dicuci lagi dengan air mengalir dan dikeringkan. Kemudian setelah itu, diteteskan lagi larutan yang keempat yaitu larutan  Gram D (Larutan safranin) dan dibiarkan selama 30 detik. Setelah sudah 30 detik kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan dengan menggunakan kertas serap.

Setelah objek glass tersebut sudah kering, maka langkah selanjutnya yaitu menutup objek glass dengan menggunakan cover glass, kemudian di letakkan diatas mikroskop dan ditetesi minnyak imersi, lalu diamati.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A.   Hasil

LaboratoriumMikrobiologiLaut JurusanIlmuKelautan Universitas Hasanuddin
Perbesaran 1:100	Keterangan:
Gambar Bakteri Bacillus subtilis

B.   Pembahasan

Pada percobaan pewarnaan mikroorganisme ini digunakan istilah Larutan Gram A, B, C dan D. Masing-masing larutan kristal violet, larutan Mordant Lugol’s Iodine, larutan alkohol 96% dan larutan safranin. Tujuan utama pemberian warna pada bakteri ini yakni untuk mengetahui bakteri yang termasuk gram positif dan gram negatif. Pada bakteri gram positif akan mengikat zat warna utama (kristal violet) dan bakteri gram negatif akan mengikat zat warna safranin (warna merah).

Sedangkan pada hasil diatas didapatkan bahwa bakteri Bacillus subtilis termasuk gram positif. Hal ini ditandai dengan warna yang diikat yaitu warna utama (kristal violet). Bakteri tersebut berbentuk lonjong, berkoloni dan berwarna ungu.

V. KESIMPULAN DAN SARAN

A.   Simpulan

Berdasarkan hasil praktikum pewarnaan mikroorganisme dengan menggunakan sampel bakteri Bacillus subtilis dapat disimpulkan bahwa bakteri Bacillus subtilis termasuk bakteri gram positif. Hal ini ditandai dengan warna yang diserap yaitu zat warna utama (kristal violet) atau warna ungu. Bentu bakteri tersebut bulat lonjong dan berkoloni.

B.   Saran

Sebaiknya mikroskop diperbanyak lagi, agar tidak terlalu lama (antri) dalam melakukan pengamatan untuk tiap kelompok.

    

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, S., 1989, Mikrobiologi Dasar. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Hadiotomo, Ratna Siri., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Pt Gramedia.

Jimmo., 2008, http ://Pembuatan PReParAT dan PengeCaTAnnyA _ BLoG KiTa.mht,. [diakses pada tanggal 14 April 2011].

Fauziah., 2008, www.fkugm2008.com/wp‑content/uploads/HSC/1‑2x/6/Praktikum6.pdf. [diakses pada tangan 14 April 2011].

Filzahazny., 2008, , http:/wordpress.com/Pengantar-tentang-bakteri.htm. [di akses pada tanggal 14 April 2011].

Rizki., 2008, http ://ngecat bakterimakul-rizki.blogspot.com/2008/02/materi- kuliah.html. [diakses pada tanggal 10 April 2011].

Volk, Wesley A dan Margareth F. Wheeler., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.

Yulneriwanti., 2008, http://01-bakteri.html. [diakses pada tanggal 15 April 2011].